Диссертация - Анализ метилирования ДНК при раке шейки матки
Содержание
ОГЛАВЛЕНИЕ Стр
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ... 5
ВВЕДЕНИЕ... 6
МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК... 9
Распространение метилирования ДНК... 9
Функция метилирования ДНК... 12
Метилирование во время развития... 13
Ферменты метилирования... 15
Метилирование как динамический процесс... 17
Роль метилирования в канцерогенезе... 20
Генетическая роль метилирования ДНК в канцерогенезе... 22
Эпигенетическая роль метилирования ДНК в канцерогенезе... 23
Сравнительный анализ современных методов определения статуса
метилирования ДНК... 33
Методы анализа статуса метилирования CpG динуклеотидов... 33
Методы идентификации CpG-островков, аберрантно-метилированных в
опухолях... 35
Заключение... 37
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ... 38
1. Список использованных реактивов... 38
2. Клинические материалы... 40
3. Выделение ДНК и РНК из клеточных культур... 41
4. Выделение ДНК из лейкоцитов... 41
5. Рестрикция геномной ДНК... 42
6. Бисульфитная модификация ДНК... 43
7. Полимеразная цепная реакция... 43
7.1. Праймеры... 43
7.2. Метилчувствительная ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами... 45
- 3 -
7.3. Метилчувствительная ПЦР со специфическими
праймерами... 46
7.4. Метилспецифическая ПЦР... 46
8. Выделение продуктов ПЦР из гелей... 47
8.1. Выделение продуктов ПЦР из полиакриламидного геля... 47
8.2. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля... 47
9. Клонирование продуктов ПЦР... 47
9.1. Вектор... 47
9.2. Получение компетентных клеток Escherichia coli... 48
9.3. Трансформация клеток Escherichia coli... 49
9.4. Выделение плазмидной ДНК... 49
10. Гель-электрофорез... 50
10.1. Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле... 50
10.2. Электрофоретическое разделение РНК в агарозном геле... 51
10.3. Электрофорез ПЦР-амплифицированной ДНК в денатурирующем полиакриламидном геле... 52
11. Блот-гибридизация... 53
11.1. Перенос ДНК на нейлоновую мембрану... 53
11.2. Перенос РНК на нитроцеллюлозную мембрану... 53
11.3. Получение меченого зонда... 54
11.4. Гибридизация ДНК (РНК), иммобилизованной на мембране... 54
12. Обратная транскрипция... 55
13. Переосаждение ДНК (РНК)... 55
14. Анализ нуклеотидных последовательностей... 55
14.1. Поиск гомологий в банках данных... 55
14.2. Критерии CpG-островков... 56
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ... 57
1. Поиск CpG-островков, гиперметилированных в опухолях шейки матки... 57
- 4 -
1.1. Принцип метода метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами... 57
1.2. Анализ фрагментов, выявленных с помощью метилчувствительной
ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами... 63
1.3. Определение статуса метилирования CpG-островка 32 при раке
шейки матки... 70
1.4. Определение полного размера CpG-островка гена (ЗЗА-адаптина... 72
2. Исследование экспрессии и статуса метилирования гена рЗА-адаптина
при раке шейки матки... 76
2.1. Исследование экспрессии мРНК гена РЗА-адаптина в опухолях шейки матки и в клеточных линиях рака шейки матки... 76
2.2. Изучение статуса метилирования CpG-островка гена РЗА-адаптина в
опухолях шейки матки и в клеточных линиях рака шейки матки... 78
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ... 86
ВЫВОДЫ... 94
ЛИТЕРАТУРА... 95
