Диссертация - Аффинные сорбенты для лечения сердечно-сосудистых заболеваний
Содержание
ОГЛАВЛЕНИЕ
стр. Список сокращений... 6
I ВВЕДЕНИЕ... 8
II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ... 12
III МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ... 61
1. Выделение антигенов... 62
1.1. Выделение липопротеидов... 62
1.1.1. Выделение ЛНП из плазмы крови человека.
1.1.1.1. Ультрацентрифугирование в ступенчатом градиенте плотности нейтральной соли бромида натрия.
1.1.1.2. Зональное ультрацентрифугирование.
1.1.1.3. Аффинная хроматография.
1.1.2. Выделение Лп(а).
1.1.2.1. Трехступенчатое ультрацентифугирование в ступенчатом градиенте плотности с последующей гель-фильтрацией.
1.1.2.2. Аффинная хроматография.
1.1.3. Получение ЛВП и делипидированной плазмы.
1.2. Очистка препарата IgG человека... 66
2. Получение антител... 67
2.1. Получение поликлональных антител... 67
2.1.1. Иммунизация животных.
2.1.2. Выделение ПкАт к ЛНП.
2.1.3. Выделение ПкАт к Лп(а).
2.1.3.1. Получение моноспецифической антисыворотки.
2.1.3.2. Очистка антител.
2.1.4. Препаративная очистка ПкАт.
2.2. Получение моноклональных антител (МкАт)... 69
2.2.1. Гибридизация и скрининг гибридомных клеток.
2.2.2. Выделение моноклональных антител из асцитной жидкости.
2.2.3. Выделение МкАтиз культуральной жидкости.
2.2.4. Препаративная очистка МкАт.
3. Синтез аффинных сорбентов... 71
3.1. Активация матриц... 71
3.1.1. Активация бромцианом.
3.1.2. Периодатное окисление.
3.2. Иммобилизация белков... 72
3.2.1. Иммобилизация липопротеидов
3.2.2. Иммобилизация антител.
3.3. Синтез сорбентов для процедур терапевтического афереза. 73
4. Определение сорбционной емкости иммуносорбентов... 73
4.1. Метод колоночной хроматографии... 73
4.2. «Batch» метод... 74
5. Анализ чистоты и специфичности белков... 74
-2-
5.1. Электрофоретические методы... 74
5.1.1. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.
5.1.2. Электрофорез в геле агарозы.
5.2. Иммунологические методы... 76
5.2.1. Метод двойной радиальной иммунодиффузии.
5.2.2. Иммуноэлектрофорез.
5.2.3. Иммуноблотинг.
5.3. Аналитическое ультрацентрифугирование... 77
6. Методы определения концентрации белков липидов... 77
6.1. Иммуноферментные методы... 77
6.1.1. Синтез конъюгатов антител с пероксидазой.
6.1.2. Определение концентрации антител к ЛНП.
6.1.3. Определение концентрации антител к Лп(а).
6.1.4. Определение концентрации антител к IgG.
6.1.5. Определение концентрации Лп(а) в плазме (сыворотке) крови человека.
6.1.6. Определение титра антител к иммуноглобулинам барана или мыши в плазме крови человека.
6.2. Определение концентрации Лп(а) методом радиальной иммунодиффузии по Манчини... 80
6.3. Определение концентрации апоВ в плазме крови... 81
6.4. Определение концентрации иммуноглобулинов G в плазме крови человека... 81
6.5. Определение концентрации суммарного белка... 81
6.6. Определение концентрации холестерина... 82
6.7. Определение концентрации холестерина в клетках... 82
7. ЛНП аферез in vitro на клеточной модели... 82
7.1. Получение образцов органных и клеточных культуры аорты человека... 82
7.2. Культивирование короткоживущей органной и клеточной культур из аорты человека... 83
7.3. ЛНП аферез in vitro на клеточной модели... 83
8. Микроскопическое исследование матриц... 83
9. Контроль качества при производстве колонок для клинического применения... 83
9.1. Определение стерильности... 83
9.2. Испытание на пирогенность... 84
9.2.1. Испытание на пирогенность на кроликах.
9.2.2. Испытание на пирогенность с использованием ЛАЛ теста.
9.3. Контроль частиц сефарозы в смывах с колонок... 86
9.4. Определение свободного белка в смывах с сорбента... 87
10. Проведение процедуры афереза с использованием иммуносорбционных колонок... 88
-3-
IV РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ... 90
1. Иммуносорбенты для ЛНП афереза... 90
1.1. Выделение и характеристика антигена - ЛНП плазмы
крови человека... 91
1.2. Иммуносорбент с ПкАт к ЛНП... 97
1.2.1. Получение ПкАт к ЛНП.
1.2.2. Характеристика ПкАт к ЛНП.
1.2.3. Синтез и характеристика иммуносорбента с ПкАт для ЛНП афереза.
1.3. Иммуносорбент с моноклональными антителами к ЛНП... 107
1.3.1. Получение и характеристика МкАт к ЛНП.
1.3.2. Свойства иммуносорбентов с МкАт к ЛНП.
1.3.3. Синтез иммуносорбента с МкАт для клинического применения.
1.4 Доказательство эффективности ЛНП афереза в опытах in
vitro... 124
1.5. Синтез и характеристика иммуносорбента для
гемосорбции... 128
1.5.1. Выбор матрицы для гемосорбции.
1.5.2. Синтез и характеристика гемосовместимого сорбента для ЛНП афереза.
1.6. Сравнение сорбентов для ЛНП афереза... 138
1.6.1. Сравнение сорбентов, применяемых для ЛНП афереза в процедурах плазмосорбции.
1.6.2. Сравнение сорбентов, применяемых для ЛНП афереза в процедурах гемосорбции.
1.7. Результаты использования иммуносорбентов для ЛНП
афереза в клинике... 159
2. Иммуносорбент для Лп(а) афереза... 168
2.1. Выделение и характеристика препарата Лп(а)... 168
2.2. Получение и характеристика ПкАт барана к Лп(а)
человека... 173
2.3. Синтез и свойства иммуносорбента с ПкАт к Лп(а)
человека... 177
2.4. Специфический Лп(а) аферез - новый подход к экстракорпоральной коррекции повышенного уровня Лп(а)... 184
2.5. Проведение процедур сочетанного ЛНП и Лп(а) афереза... 191
3. Сорбент с иммобилизованными ЛНП плазмы крови
человека... 194
3.1. Изучение эффекта «атерогенности» при помощи сорбента
с иммобилизованными ЛНП плазмы крови человека... 195
3.2. Клиническое применение сорбента с иммобилизованными
ЛНП плазмы крови человека... 201
4. Иммуносорбент для афереза иммуноглобулинов у
больных дилатационной кардиомиопатией... 206
-4-
4.1. Выделение и характеристика препарата IgG человека... 207
4.2. Получение и характеристика ПкАт барана против IgG человека... 210
4.3. Синтез и характеристика иммуносорбента с ПкАт против
IgG человека... 211
4.4. Разработка дизайна процедур Ig афереза с
использованием колонок с анти-Ig сорбентом... 218
4.5. Первый опыт лечения больных ДКМП методом иммуносорбции на колонках «Ig Адсопак»®... 223
5. Вопросы безопасности и технология производства
аффинных колонок для терапевтического афереза... 230
V ЗАКЛЮЧЕНИЕ... 237
VI ВЫВОДЫ... 242
VII СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ... 246
VIII ПРИЛОЖЕНИЯ... 280
-5-
