Диссертация - Молекулярно—генетический анализ распространения токсигенной микрофлоры
Содержание
Содержание Стр. Введение 3
1. Обзор литературы
1.1. Систематика семейства Enterobacteriaceae... 6
1.2. Факторы патогенности и генетический контроль синтеза энтеротоксинов... 7
1.3. Классификация и молекулярная организация энтеротоксинов... 9
1.4. Механизм действия энтеротоксинов ... 13
1.5. Методы детекции токсигенной микрофлоры ... 14
1.5.1. Методы биологического тестирования энтеротоксинов ... 14
1.5.2. Иммунологические методы детекции энтеротоксинов ... 17
1.5.3. ДНК-ДНК гибридизация ... 20
1.5.3.1. Принцип метода гибридизации. Методы гибридизации ... 21
1.5.3.2. Гибридизационные ДНК-зонды ... 23
1.5.3.3. Введение метки в нуклеиновые кислоты... 28
1.5.3.4. Способы введения метки в ДНК-зонды ... 32
1.5.4. Полимеразная цепная реакция ... 34
1.5.4.1. Принцип метода ПЦР ... 34
1.5.4.2. Этапы полимеразной цепной реакции ... 36
1.5.4.3. Компоненты реакционной смеси ПЦР ... 37
1.5.4.4. Условия проведения ПЦР ...;... 39
1.5.4.5. Детекция результатов ПЦР... 41
1.5.4.6. Интерпретация результатов ПЦР ... 42
1.5.4.7. Способы повышения чувствительности ПЦР ... 43
1.5.4.8. Достоинства метода ПЦР ... 47
1.5.4.9. Практическое применение ПЦР при диагностике токсикоинфекций 48 Собственные исследования
2. Материалы и методы ... 51
2.1. Оборудование ... 51
2.2. Использованные реактивы ... 51
2.3. Буферные растворы ... 51
2.4. Штаммы и плазмиды ... 52
2.5. Питательные среды ... 52
2.6. Определение биохимических свойств культур ... 53
2.7. Получение биомассы... 53
2.8. Выделение плазмидной ДНК ... 53
2.9. Очистка плазмидной ДНК ... 54
2.10. Электрофорез ДНК ... 54
2.11. Расщепление плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции ... 54
2.12. Извлечение ДНК из легкоплавкой агарозы ... 55
2.13. Выделение ДНК из агарозных гелей с использованием сорбента GlassMilk ... 56
2.14. Генетическая трансформация E.coli ... 56
2.15. Введение биотиновой метки в препараты ДНК ... 57
2.16. ДНК-ДНК гибридизация с биотинилированными зондами ... 58
2.17. Детекция результатов гибридизации ... 58
2.18. Полимеразная цепная реакция ... 59
2.19. Подбор оптимальных условий проведения ПЦР ... 59
3. Результаты исследований... 61
3.1. Выделение штаммов энтеробактерий, контаминирующих кормосмеси для норок... 61
3.2. Изучение биохимических свойств штаммов и их идентификация ... 63
3.3. Определение патогенности изолированных штаммов ... 69
3.3.1. Биологические методы тестирования ... 69
3.3.1.1. Изучение патогенных свойств подкожным введением ... 69
3.3.1.2. Определение наличия токсинообразования ... 69
3.3.1.2.1. Определение наличия термостабилыюго токсина ST ... 69
3.3.1.2.2. Определение наличия термолабилыюго энтеротоксина LT ... 71
3.3.2. Молекулярно-генетические методы тестирования ... 73
3.3.2.1. Конструирование диагностических ДНК-зондов ... 73
3.3.2.1.1. Получение зондов на гены отдельных субъединиц термолабильного токсина ... 73
3.3.2.1.2. Биотинилирование зондов и определение включения метки ... 77
3.3.2.1.3. Получение зонда на полни размерный LT-оперон ... 80
3.3.2.2. Анализ штаммов на наличие генов токсинообразования ... 84
3.3.2.2.1. Оптимизация условий гибридизации ... 84
3.3.2.2.2. Изучение распространения генов токсинообразования методом ДНК-ДНК гибридизации ... 86
3.3.2.2.3. Определение генов шига-подобных токсинов SLTI и SLTII методом гибридизации с радиоактивным зондом ... 89
3.3.2.3. Разработка метода полимеразной цепной реакции для детекции генов токсинообразования у энтеробактерий ... 91
3.3.2.3.1. Анализ первичных последовательностей и подбор праймеров ... 91
3.3.2.3.2. Оптимизация условий проведения полимеразной цепной реакции 92
3.3.2.3.3. Изучение распространения генов токсинообразования методом ПЦР ... 93
4. Обсуждение результатов ... 102
5. Выводы ... 116
6. Сведения о практическом использовании результатов ... 117
7. Список литературы... 118
8. Приложения ... 138
